最好的白癜风医院在哪 https://m-mip.39.net/nk/mipso_4440903.html编者按
自CharlesChiu年在NewEnglandJournalofMedicine发表文章，将mNGS应用到临床以来，该领域世界领先的学者们和予果的研发人员一样，从来没有停止对mNGS的优化。Cell-freemNGS的方法学也随着科学技术的发展越来越受到重视，今年年初，领域大牛CharlesChiu的NatureMedicine的文章，运用Cell-free的方法学，对多种体液标本进行了mNGS的检测，获得了很好的结果。借此机会，予果也将历年来发表的Cell-freemNGS的文献进行了梳理，将在这个系列中为大家一一呈现。
科研必须踏实，解读必须精准。
新年伊始之际，美国加州大学CharlesChiu团队成功地对多种体液中的游离DNA进行mNGS检测。相应研究发表在世界著名杂志《NatureMedicine》（IF=36）上。该研究采用两种测序平台对例患者的例体液进行了Cell-freemNGS检测并对其结果进行了评估，与采用培养、细菌16SPCR和/或真菌28S-ITSPCR等常规微生物检测进行了方法学比较。结果表明：Illumina测序检测细菌的灵敏度和特异性分别为79%和91%，真菌的分别为91%和89%；而在纳米孔测序平台中，检测细菌的灵敏度和特异性分别为75%和81%，真菌的分别为91%和%。在12例体液培养和PCR均为阴性，但最终确诊感染的患者中，7例（58%）mNGS检测结果为阳性。在纳米孔测序平台中，实时计算分析可以在中位50分钟的测序时间和6小时的样本应答时间内对病原体进行鉴定。
◆研究背景
重症感染性疾病的致病微生物早期诊断对于临床干预和抗感染治疗的展开至关重要。目前，对许多住院患者来说，及时准确的诊断仍然具有很高的挑战性。一方面，大多数感染综合症难以区分临床表现，迫切需要广泛、多种诊断试验，但对绝大多数潜在病原体还没有可用的诊断试验。另一方面，有些微生物很难在培养环境中生长或不能培养，另一些微生物则需要数周的时间才能生长并形成单克隆。尽管针对细菌和真菌的保守基因PCR检测已经开发出来，但其检测灵敏度也并非完全令人满意。
mNGS技术可以从临床样本中检测出几乎所有已知的病原体，但一般主要是无脓性体液类型的检测。之前mNGS的应用，多为在Whole-cell全细胞的mNGS，但是其高浓度的宿主DNA背景会降低mNGS检测灵敏度。此外，应用最为广泛的Illumina测序平台总周转时间在48-72h之间，而新的纳米孔测序平台有望在6h之内提供病原信息。但该技术在病原体检测中的临床宏基因组应用同样受到样本宿主DNA的干扰。因此，本研究开发了一种可以无差别检测体液中的细胞游离核酸（Cell-free）来识别病原体的mNGS技术，打破这一应用的桎梏。
◆研究方法
样本收集：共收集例患者份体液标本，其中脓肿25份，关节部21份，胸膜32份，腹膜27份，脑脊液35份，支气管肺泡灌洗液13份，其他体液29份等；样本分配：在这份样本中，例用于Illumina测序平台准确性的验证，其中有例阳性培养样本、9例培养阴性但16S细菌PCR和/或28S-ITS真菌PCR阳性样本，以及34例非感染性样本作为阴性对照；剩下的12例常规检测阴性，但正交实验证实存在感染的样本；实验方法：个样本做临床培养以及9例假阴性样本和34例阴性对照做PCR验证；然后，临床样本随机分为训练集（n=43个样本，36个细菌和8个真菌）和验证集（n=个样本，85个细菌和32个真菌）进行Illumina测序；以及用于纳米孔测序的训练集（n=42个样本，34个细菌和7个真菌）和验证集（n=43个样本，43个细菌和11个真菌）；最后，剩下的12例样本做mNGS检测，用于评判mNGS方法的临床可行性；最终对两类三种检测方法的敏感性、时效性进行比较和分析（如下图所示）。
◆研究结果
1、测序数据量
由于Cell-freemNGS的特性，对于数据量的要求并不高。本研究中，Illumina平台的测序量的中位数为7.2MReads数，四分位距为4.0-8.3M，全部样品的测序量的范围在0.15M到35M之间。而nanopore平台因其读长长，数据则更少，其测序量的中位数为1.1MReads，四分位距为1.0-1.5M，全部样品的测序量范围在0.29-6.7M。2、Cell-freemNGS检测的准确性及体液样品中病原菌的相对负荷基于培养和16S检验的Illumina（n=43个样本）和纳米孔（n=42个样本）训练集的ROC曲线(图a)、基于复合标准的两个训练集的ROC曲线(图b)表明Illumina测序平台诊断效能要优于纳米孔平台；基于训练集而言，Illumina测序平台细菌检测的敏感性和特异性分别是79.2%和90.6%，真菌是90.6%和89%，而纳米孔测序平台针对细菌是75%和81.4%，真菌是90.9%和%，基于检验集的Illumina测序平台检测的敏感性和特异性分别是80.0%和95.3%，而纳米孔测序是81%和93%（图c)；除血浆外，不同体液类型的mNGS检测总体上具有可比性(图d)，脑脊液检测的准确性最高。纳米孔测序得到的标准化计数与Illumina测序相似（P=0.59）(图e)。根据nRPM计数，真菌DNA的平均浓度显著低于细菌DNA（P=0.）(图f)。3、mNGS与16S（细菌）或28S-ITS（真菌）PCR比较对14个临床高度怀疑感染的样本用mNGS与16S（细菌）或28S-ITS（真菌）PCR的方法进行比较：其中8例mNGS结果与PCR检测一致，6例不一致病例中，5例只有mNGS检出阳性，1例只16SPCR检出阳性，因此mNGS检测的准确性和特异性分别是86%和%（图a、b）；
三个不一致的细菌病例其中一个是免疫功能低下的儿童坏死性肺炎，胸液16SPCR检测为链球菌，而mNGS检测发现是肺炎克雷伯菌，5个正交实验发现mNGS发现肺炎克雷伯菌是真正的致病病原（图c）；在所有三个不一致的真菌病例中，体液mNGS能够找到致病微生物，而真菌28SITSPCR检测是阴性，通过相同体液培养（n=1）、24d后培养（n=1）或脑活检组织检测（n=1）证实了病原菌（图d）。
4、体液和血浆样本中病原体负荷比较在本研究中，运用体液和血浆共同检出病原体的病例有7名，他们一共被检出了9种病原体，Cell-freeDNA检测发现，同一病人局部体液的病原体负荷为血浆中的倍（中位数倍数）（图a、b）。因此，体液比血液更利于病原体的检测。
◆总结
1.对于Cell-freemNGS的检测，Illumina和nanopore测序平台对细菌和真菌检测的敏感性和特异性是相似的，且准确性、敏感性都高于常规检测方法；2.Cell-freemNGS的方法只需要很少的数据量，就能够得到较好的检出；3.本研究发明的Cell-freemNGS胜任各类型体液样本的检测，无论是Illumina平台还是纳米孔测序平台，都有极高的准确性和特异性。
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